NOD／SCID小鼠模型在实验血液学研究中的应用于文俊1，杨文华2，史哲新2，杨向东2，王慧娟1(1．天津中医药大学，天津；2．天津中医药大学第一附属医院血液科，天津)【摘要】NOD／SCID(非肥胖糖尿病／重症联合免疫缺陷)小鼠是在SCID(重症联合免疫缺陷)小鼠的基础上与非肥胖性糖尿病小鼠(NOD／1。t)品系回交的免疫缺陷鼠。NOD／SCID小鼠既有先天免疫缺陷，又有T和B淋巴细胞缺乏，各种肿瘤细胞可以植入，且较少发生排斥反应及移植物抗宿主病(GVHD)，所以NOD／SCID小鼠逐渐成为血液学实验研究的有用工具。本文从NOD／SCID小鼠的生物学特性、建立人类白血病模型、干细胞移植、药物研究及NOD／SCID小鼠应用中存在的不足和改良等方面综合述评。【关键词】NOD／SCID小鼠；实验血液学；动物模型【中图分类号】R652【文献标识码】A【文章编号】1005—4847(2008)05．0391．05Application ofNOD／SCIDMouseModel inExperimentalHematologyResearchYUWen．junI．YANGWen—hua2．SHIZhe—xin2．YANGXiang—don92．WANGHui—juanl(1．TianjinUniversity ofTraditionalChineseMedicine，Tianjin，China；2．Department ofHematology，TheFirstAffiliatedHospital ofTianjinUniversity ofTCM，Tianjin)【Abstract】NOD／SCID(non．obese diabetic／severe combined immunodeficient)mice are immunodeficient mice which are generated by backcrossing severe combined immunodeficient mice with non—oi)ese diabetic mice strains．NOD／SCID mice are both innate immunodeficient and lack ofT andB lymphocytes．Various tumor cells can be implanted in those mice with few occurrence of rejection and graft—versus—host disease(GVHD)．Therefore，NOD／SCID mice gradually become a useful tool in studies of experimental hematology．This paper is a comprehensive review of the biological characteristics ofNOD／SCID mice，and their application in the establishment of human leukemia model，research on stem cell transplantation，drug research，and the drawbacks and improvement of application ofNOD／SCID mice．【Key words】NOD／SClD mice；Experimental hematology；Animal modelNOD／SCID(非肥胖糖尿病／重症联合免疫缺陷)小鼠…是在SCID(重症联合免疫缺陷)小鼠的基础上与非肥胖性糖尿病小鼠(NOD／Lt)品系(TL，BL，NK细胞缺陷，循环补体缺乏，抗原呈递细胞分化及功能不良)回交得到的。既缺乏T和B淋巴细胞功能，又有先天免疫缺陷，是一种免疫缺陷更严重、更适合目前血液学实验研究的动物模型。[基金项目]国家自然科学基金资助(编号：)；天津市应用基础研究项目(07JCYBJCl1500)。[作者简介]于文俊(1980一)，男，河南淮阳人，天津中医药大学2006级硕士．E．mail：ywjl@yahoo．cn[通讯作者]杨文华，女，主任隈师，教授，博士生导师，电话：022—NOD／SCID小鼠的生物学特性SCID小鼠是1983年美国学者Bosma、2 o首先在 c．B—17近交系小鼠中发现的，由位于16号染色体的SCID隐性基因突变所致。SCID小鼠的T、B淋巴细胞功能缺陷，但巨噬细胞、NK细胞及淋巴因子激活细胞(LAK)等均正常。具有免疫缺陷特性的SCID小鼠可以成功接种各种肿瘤细胞并反映其在体内的生物学行为。但是由于SCID小鼠体内存在正常的NK细胞，补体及髓系细胞的正常免疫¨1，一小部分周龄较大的SCID小鼠会发生免疫逃逸，产生B和T细胞，降低了细胞植入存活率。为了更好地进行白血病模型的建立与研究，研究者将SCID小鼠与非肥胖性糖尿病小鼠NOD／Lt回392中国实验动物学报2008年10月第16卷第5期ActaLabAnitaSciSin，October，2008，Vol16，No．5交而得到NOD／SCID小鼠。该系鼠既拥有C．B一17SCID鼠的特征，缺乏适应性免疫系统，不再发生自身免疫性糖尿病，同时还表现出NOD鼠所具有的多种固有免疫缺陷，包括NK细胞活性低、骨髓功能发育不正常(巨噬细胞对LPS反应性分泌ILl的能力下降)、约30％纯合子无补体成分c5并缺乏补体系统的溶血活性‘41，是一种更易于异种移植成功的动物模型。Hesselton等’筛查实验评价了一系列SCID小鼠与不同遗传背景品系的小鼠回交的后代，发现NOD／SCID对人外周血移植水平较其他遗传品系SCID小鼠高5至10倍。Shuhz等6。的研究表明C．B一17SCID鼠约90％可发生免疫渗漏，而NOD／SCID鼠会发生免疫渗漏不到10％。目前，NOD／SCID已成为人体造血细胞研究中应用最广、最为重要的异体移植模型。2在人白血病细胞研究中的应用宋氏等…将K562白血病细胞接种于全身受照射后的裸鼠，待皮下成瘤后取出局部瘤块，制成瘤细胞悬液，再腹腔接种于全身受照射后的NOD／SCID小鼠，成功建立全身播散的K652一NOD／SCID白血病模型。每只小鼠接种2×107个瘤细胞，接种后4周外周血均可见白血病细胞，而在晚期白细胞数上升为接种前的8～10倍，且发病晚期外周血白血病细胞比例一般为20％～30％，发病率为100％。该模型较好地反映白血病在体内的演变过程，是进行新药疗效试验、生物导向治疗及基因治疗的理想工具。黎氏等。8用NOD／SCID小鼠移植K652白血病细胞株也获得成功，接种低至1X106肿瘤细胞也是可行的。郭氏等∽!将NOD／SCID小鼠建立白血病模型后注射内皮细胞(EC)，通过免疫组织化学对NOD／SCID小鼠骨髓血管生成进行鉴定，显示骨髓微血管密度(MVD)，见白血病骨髓新生微血管分支多紊乱，管腔较不规则，该模型可能成为评价抗肿瘤血管生成疗效的理想动物模型。Nicolini等【10。用表达人造血生长因子IL一3、GM—CSF、SF的逆转录病毒载体转染的小鼠骨髓细胞给NOD／SCID小鼠接种，将人造血干细胞或胎肝细胞移植到这些产生人造血生长因子的NOD／SLID小鼠体内，发现人髓系细胞数明显增加，人造血干细胞明显向髓系分化，而红系细胞和淋巴系细胞则明显减少。转人造血生长因子基因的免疫缺陷小鼠可望进一步用于制备较为理想的人CML一小鼠实验模型。20世纪90年代Dick等…将白血病细胞移植人受照射的NOD／SCID小鼠，发现起始小鼠白血病发生的细胞均为CD34+CD38一，而CD34+CD38+白血病细胞则不能在小鼠体内起始白血病。这一研究以再植NOD／SCID小鼠模型能力为基础首次鉴定免疫表型特异的白血病细胞群体，证实了白血病干细胞的存在。随后Dick在1999年的美国血液病年会上作了关于白血病干细胞的专题讲演，确立了白血病干细胞的概念。由于可操作性好，目前NOD／SCID模型已被广泛应用于白血病干细胞的研究¨2J。不同FAB亚型AML(M3除外)白血病细胞可以在SCID和NOD／SCID鼠内高水平植活，在NOD／SCID植活率更高，且白血病细胞所需数量少，可定量分析白血病启动细胞、白血病细胞形态特点及一些临床特征，如颅内浸润，可以在NOD／SCID鼠体内得到重复。国内学者取CML患者骨髓，分离单个核细胞¨3。，常规接种培养，免疫磁珠分选CD45一、GlyA及CD34的贴壁细胞，植入经亚致死量照射的NOD／SCID小鼠体内。检测到植入的CML患者骨髓源BCR／ABL+、Flkl+CD34一细胞在受体小鼠体内分化为白血病细胞，受体小鼠骨髓细胞中存在Bcr／Abl融合基因阳性细胞。说明Bcr／Abl融合基因阳性Flkl+CD34细胞具有白血病干细胞特性，可能是CML发生发展的始动细胞。3在人脐血细胞体外扩增后移植研究中的应用人脐血移植在临床上广泛地应用于血液病和急性辐射损伤等患者的造血重建，但单份脐血中所含的造血细胞数往往只能用于儿童或低体重成人患者¨“，而采用脐血体外扩增的方法可克服这一障碍。通过体外扩增，移植于经过预处理的NOD／SCID小鼠体内，来检测移植成功与否，为临床和科研提供依据。毛氏等¨5。应用人脐血MNC在干细胞因子(SCF)、酪氨酸激酶受体3配基(FL)、白细胞介素6(IL一6)和白细胞介素3(IL一3)细胞因子共同作用下，培养6～10 d获得最佳扩增效果；移植于照射处理的NOD／SCID小鼠，6周后，有55．6％的小鼠存活，存活小鼠的骨髓、脾和胸腺细胞中均能检测出人类CD45、CD34、CD33、CD3和CDl9抗原，外周血提取的DNA可检测出人特异的Cart—I基因和Alu基因。表中国实验动物学报2008年JO月第16卷第5期ActaLabAnimSciSin，October，2008，Vol16，No5393明人脐血MNC扩增6 d后可成功植入NOD／SCID小鼠体内，并帮助小鼠重建多系造血。Ando等¨6。将脐血纯化的CD34一Lin亚群，在含有鼠基质细胞株(HESS。5)和6种细胞因子体系下扩增，30 d后获取107CD34+细胞，后者植入NOD／SCID小鼠体内获得长期造血重建。这为临床造血干／祖细胞移植和基因治疗提供了新型CD34+细胞来源。周氏等”。的研究结果表明含人脐血来源的间充质干细胞(MSCs)联合造血生长因子(HGFs)体外扩增6 d后的脐血造血细胞移植人NOD／SCID小鼠体内，显著促进移植后小鼠造血恢复，提高小鼠存活率，且结果显示主要是促进小鼠髓系和巨核系的植入，但对淋巴系的植入有抑制作用。冯氏等。18。联合血小板生成素(TPO)、白细胞介素．1l(IL一11)和肝素用脐血CD34+细胞定向扩增巨核祖细胞。将扩增第7天的巨核细胞(浓度为5×106)静脉输注于经放射预处理的NOD／SCID小鼠，可明显加速其血小板及白细胞的恢复并提高小鼠生存率。Lam等¨9通过研究生长因子、去血浆媒体和自体血浆在脐血细胞扩增中的应用和将扩增的产品移植给NOD／SCID小鼠，为临床建立适用的培养体系。经过最优化条件的扩增后，所培养的细胞移植给经亚致死剂量照射的NOD／SCID小鼠，显示应用最优化条件可应用于临床扩增以防止或减轻移植后血细胞减少症。4在促进造血干祖细胞归巢和造血及免疫重建研究中的应用有研究表明【2“脐带源间充质干细胞(hUC—MSC)在促进造血细胞归巢、提高造血干细胞植入中有肯定作用。将hUC—MSC和CFDA—SE荧光标记的人脐带血单个核细胞(MNC)植入NOD／SCID小鼠建立共移植模型，分离共移植24 h后小鼠骨髓有核细胞，证实了hUC．MSC具有引导脐带血MNC在NOD／SCID小鼠体内向造血巢——骨髓富集(归巢)的作用。Peled等。21。证明，趋化因子SDF．1及其受体CXCR4对于移植到NOD／SCID小鼠体内的人HSC归巢具有决定性作用。国内学者=22一应用人脐血间充质干细胞(MSC)联合人脐血CD34+细胞植入NOD／SCID小鼠体内并检测其造血恢复，同样证实了人脐血MSC联合移植可提高人脐血CD34+细胞在小鼠体内的植入率，加速NOD／SCID小鼠各系造血恢复，提高移植小鼠存活率，并可促进人脐血CD34+细胞在NOD／SCID小鼠体内向粒系、B淋巴系和巨核系定向分化。林氏等。23。研究应用脐血中CD34+细胞，尾静脉输入亚致死剂量照射NOD／SCID小鼠，6周后在模型小鼠骨髓中检测到部分人TCR vp亚家族基因v13l、2、9、13、19。经进一步基因扫描分析，发现部分TCR v|3亚家族基因vB9、13、19呈寡克隆表达。表明在NOD／SCID模型可重建分化成熟的TCR v8亚家族T细胞。未能检测到全部人TCR v阳细胞的原因可能与免疫重建不完全或存在移植物抗宿主的反应有关。作者在另一研究中指出脐血T细胞能在NOD／SCID小鼠抗原刺激下增殖，提示在应用脐血干细胞构建人源化NOD／SCID小鼠模型时，应考虑人源免疫细胞产生的移植物抗宿主反应(GVHR)对实验结果的影响。2…。5在抗血液病药物筛选和基因治疗研究中的应用丙戊酸(valproic acid，VPA)是一种常用的抗癫痫药，最近证实VPA在抗癫痫有效治疗浓度时(血药浓度0．3～1 mmol／L)表现出很强的组蛋白去乙酰化酶抑制剂(inhibitors of histone deacetylases，HDACIs)活性，并可诱导白血病细胞分化、细胞凋亡l25I，Bcl一2的小分子配体HAl4—1通过抑制Bcl一2，诱导细胞凋亡，已经汪实Bcl一2高表达细胞对其更加敏感。薛艮26。等观察单独和联合应用上述2种药物于Bcl一2高表达的人白血病细胞B—ALL．1的NOD／SCID小鼠模型，验证两药对BALL，1的杀伤效能。发现在接种了Bcl一2高表达人白血病细胞B．ALL．1的NOD／SCID鼠，联合给予HAl4—1与VPA确实有抗白血病的效果。低剂量HAl4一l与VPA联合用药，可克服Bcl一2高表达造成的对VPA的抗性，这种联合用药的方法有可能成为白血病治疗的新选择。目前，以造血干细胞为靶细胞的基因治疗技术逐渐成熟，各种免疫缺陷模型如NOD／SCID模型已被用来研究转染的形式、效率、安全性以及转基因造血干细胞的骨髓再造能力h“。有研究者已经能利用慢病毒载体(1entiviral vector)转染未经细胞因子刺激和长期体外培养的脐血来源造血干细胞，将转染后的干细胞回输至NOD／SCID小鼠体内能重建造血。朱氏。28。等在研究人中期胚胎脐血间质干细胞(MSC)生物学特性及其在自体宫内基因转移／治疗394}’国实验动物学报2008年lO月第16卷第5期ActaLabAnitaSciSin．October，2008，V01．16，No．5(IUGT)领域的应用前景的实验中，将NOD／SCID小鼠皮下注射MSC l×104 cells／10似L，病理切片检测第30 d细胞体内成瘤性。结果未出现瘤样病变，实验表明将人中期胚胎脐血MSC作为IUGT靶细胞较安全，理论上不会导致胚胎形成肿瘤。6NoD／SCID小鼠模型的不足和新改良品种NOD／SCID小鼠缺乏T、B、NK细胞，可以允许人造血干细胞在其体内高水平植入，而且移植后在受体鼠外周血中检测到人源性细胞。但是该模型也有一些缺陷。2…：①8个月后大部分小鼠出现胸腺淋巴瘤或死亡，因而不能进行长期追踪；②对放射高度敏感，4Gy7射线照射后即可导致造血系统衰竭而死亡；③造血微环境主要为鼠源性，因而仍在一定程度上阻碍了人HSC的植活和发育。为克服NOD／SCID小鼠的不足，人们尝试在其基础上开发出更适合的动物模型。NOD／SCID／p．2m““小鼠。30。是通过基因打靶获得的p一2m”“(8：．微球蛋白等位基因缺失)小鼠与NOD／SCID小鼠回交产生的。该小鼠缺乏鼠类MHCI类分子，NK细胞水平极低。目前，正在开发鼠类MHCⅡ类分子缺失小鼠、人MHC分子转基因小鼠等模型。NOD／SCID／7…“小鼠。3“是SCID突变和 interleukin一2R7(IL—R7)等位基因突变(7c””)的双重纯合子。它是将NOD／SHI—SCID小鼠和C57B／6J一7c”“经8次回交产生的。该小鼠更易移植成功且在低细胞水平移植中更具优势，目前已作为多种异体基因移植的模型，亦用于胚胎干细胞分化的功能检测。Shultz等’321将重组活化基因(recombination— activating gene，Ra91)与NOD／LtSz小鼠10次回交，得至0NOD／LtSz—Ragl””／J、鼠。NOD／LtSz—Ra91”“／J、鼠缺乏成熟T细胞和B细胞，NK细胞活性低。由于缺乏Ragl活性，不能进行Ig、TCR的V(D)J基因重排，致功能性T，B细胞缺陷。具有：患淋巴瘤时问晚、寿命长、抗放射线能力强、终生血清Ig缺陷的优势。RAG，√一／gamma c一双突变小鼠是Mazurier等33用一种重组酶激活基因．2(RAG，)和细胞因子受体共同7链(gammaC)双突变小鼠。该型T、B、NK淋巴细胞完全缺陷，无白发肿瘤形成。和NOD／SCID小鼠相比，该模型中脐血造血细胞植入率可因辅助治疗明显提高，故该型对干细胞的细胞因子调控分析有重大意义。参考文献一1]ProchazkaM，GaskinsHR，ShuhzLD7rile nonohese diabeticSCII) nlouse：model for spontaneous thymomagenesis associated with ifnITlunode“ciencv[J]Prt)【-NatlAcadSciU我SA，1992，89(8)：3290—3294[2][3]4][5][6[7 j[8][9110][12][13][14][15]BosmaGC，CusterRP．BosmaMJ．A severe combined油muno(1eficiencv mutation in the mouse【JJNature，1983，301：527—530．DorshkindK，PollackSB，BosniaMJ，et alNatural killer(NK) cells are present in mice with severe combined inlnumodeficien(’v(SCID)[J]．1nununology，1985，134：3798—3801．GreinerDL，HessehOilRA，ShuhzLD，et alSCID mouse models('f human stem cell engraftment[J]．StemCells，1998，16(3)：166一177．HessehonRM，GreinerDL，MordesJP，et alHigh levels of human peripheral blood munonuclear cell engraftment and enhanced susceptibility to human imHnJnode“ciencv virus type1 infection inNOD／LtSz—scid／seid 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文章来源：《中国实验血液学杂志》 网址: http://www.zgsyxyxzz.cn/qikandaodu/2021/0709/672.html